一、qPCR 技术原理
荧光定量 PCR（quantitative PCR, qPCR）是一种在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，通过实时监测荧光信号的变化来定量分析起始模板量的分子生物学技术。aperbio 荧光定量 PCR 仪采用先进的光学检测系统和精准的温度控制模块，确保实验结果的准确性和重复性。
二、实验设计要点
1. 引物设计原则
- 引物长度：18-25bp
- Tm 值：55-65℃，上下游引物 Tm 值相差不超过 2℃
- GC 含量：40-60%
- 避免引物二聚体和发夹结构
- 扩增产物长度：80-200bp
2. 内参基因选择
- 常用内参：GAPDH、β-actin、18S rRNA
- 内参基因应在不同实验条件下表达稳定
- 建议使用多个内参基因进行标准化
三、反应体系优化
1. 反应组分
- 2×qPCR Master Mix：10μL
- 上游引物（10μM）：0.5μL
- 下游引物（10μM）：0.5μL
- cDNA 模板：1-2μL
- ddH2O：补足至 20μL
2. 反应程序
- 预变性：95℃ 30 秒
- PCR 循环（40 个循环）：95℃ 5 秒，60℃ 30 秒
- 熔解曲线分析：65-95℃，每 0.5℃采集一次荧光
四、数据分析方法
1. 相对定量（2^-ΔΔCt 法）
- 计算ΔCt = Ct(目的基因) - Ct(内参基因)
- 计算ΔΔCt = ΔCt(处理组) - ΔCt(对照组)
- 计算相对表达量 = 2^-ΔΔCt
2. 绝对定量
- 制备标准品梯度稀释系列
- 绘制标准曲线
- 根据 Ct 值计算样品中模板的绝对拷贝数
五、常见问题排查
问题 1：扩增效率低
- 可能原因：引物设计不当、反应体系不优化
- 解决方案：重新设计引物，优化 Mg2+ 浓度
问题 2：熔解曲线出现多峰
- 可能原因：非特异性扩增、引物二聚体
- 解决方案：优化退火温度，重新设计引物